Al centro del dipinto, la Madonna in trono col Bambino viene incoronata da due angeli sopra di lei, circondati da angeli musicanti in cielo. In alto vola la colomba dello Spirito Santo, un richiamo al nome della chiesa in cui è conservata questa pala d’altare. La Madonna presenta il Bambino benedicente a sant’Agostino alla sua destra, titolare dell’altare su cui venne collocata l’opera. All’estrema sinistra del dipinto si nota un’elegante santa Caterina con la ruota dentata del suo martirio. A destra del quadro troviamo un accigliato sant’Antonio abate e accanto a lui san Sebastiano, con le frecce del martirio, avanza verso Gesù bambino.

Ai piedi del trono, Lotto raffigurò san Giovannino mentre abbraccia con impeto giovanile l’agnello sacrificale, come recita il suo cartiglio «ECCE AGNUS DEI».

In primo piano, sotto al drappo, sbuca un foglio con la firma dell’artista.